免疫印跡檢測（WB）操作步驟

免疫印跡檢測的主要原理是在蛋白電泳分離蛋白的基礎(chǔ)上，利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來檢測目的蛋白，是一種定性能力強(qiáng)并具有半定量檢測能力的免疫分析方法。實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1. 樣品制備: 利用RIPA裂解液裂解細(xì)胞或組織樣品，4℃、10000g離心10分鐘，取上清液進(jìn)行蛋白定量，然后將所有樣品校正到同一蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液,95℃金屬浴加熱10分鐘，冰浴冷卻樣品。

2. 電泳：配制聚丙烯酰胺凝膠（根據(jù)目的蛋白分子量配制不同濃度凝膠），將樣品加入凝膠上樣凹槽，90V電壓和300mA電流條件下電泳至樣品中溴酚藍(lán)跑出凝膠。

3. 電轉(zhuǎn)：取PVDF膜，甲醇浸泡10分鐘，然后將膜置于電轉(zhuǎn)夾正極（下面墊上海綿墊和濾紙），電泳后的聚丙烯凝膠置于PVDF膜上，排除氣泡，再鋪上濾紙和海綿墊，再將電轉(zhuǎn)夾置于電轉(zhuǎn)槽中，120V電壓和300mA電流條件下電轉(zhuǎn)2小時(shí)（根據(jù)目的蛋白分子量可以適當(dāng)調(diào)整電轉(zhuǎn)時(shí)間）。

4. 封閉：電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取出PVDF膜，利用TBS緩沖液潤洗后，放入5%脫脂牛奶中（TBS配制）室溫震蕩封閉1小時(shí)。

5. 一抗孵育：將PVDF膜的目的蛋白區(qū)域剪切下來，放到包被封口膜的玻璃板上，在膜上滴加0.5～1.5ml封閉液配制的一抗溶液室溫孵育3小時(shí)或4℃過夜。

6. 清洗：將PVDF膜放入TBST（含0.1%吐溫20的TBS）震蕩清洗3次，每次5分鐘。

7. 二抗孵育：將PVDF膜再次放到包被封口膜的玻璃板上，在膜上滴加0.5～1.5ml TBST配制的二抗溶液室溫孵育2小時(shí)。

8.清洗：將PVDF膜放入TBST（含0.1%吐溫20的TBS）震蕩清洗3次，每次5分鐘。

    9.上機(jī)檢測。